Page 445 - เอกสารประกอบการประชุมวิชาการ ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น ประจำปี 2563 เล่มที่ 1

440

วิธีการด าเนินการ

1. การส ารวจเก็บตัวอย่างอ้อยและแยกเชื อแบคทีเรีย
ส ารวจโรคและเก็บตัวอย่างอาการโรคอ้อยจากแหล่งปลูกของเกษตรกร จังหวัดขอนแก่น นครราชสีมา

็
และก าแพงเพชร การแยกเชื้อแบคทีเรีย เลือกตัดชิ้นส่วนพืชทแสดงอาการ โดยตัดบริเวณทเปนโรคและไม่
ี่
ี่
่
ื้
ุ่
่
ิ้
ิ้
ิ
เป็นโรค ขนาดชนสวนพืชประมาณ 0.5 x 0.5 มิลลเมตร 1-2 ชน จมแชในน้ านึ่งฆ่าเชอ นาน 1-2 นาท ใช ้
ี
ี
ั
่
ปากคบฆ่าเชอหยิบชนสวนพืชดงกลาว วางบนหยดน้ า 10-20 ไมโครลตร ตดให้เป็นชนเลก ๆ ทงไว้ 3-5
ื้
่
ิ้
ิ้
ิ
ั
็
ิ้
้
ื้
้
ู
ี่
ื้
ี้
นาทแลวใชลปทฆ่าเชอ จมในหยดน้ า น ามาลาก (streak) บน อาหารเลยงเชอ วางจานเลยงเชอใสใน
่
ื้
ี
ี้
ุ่
ื้
ื
ี่
ิ
ถุงพลาสตก คว่ าจานลง บ่มเชอไว้ทอุณหภูมิห้อง (ประมาณ 30 องศาเซลเซียส) 1-2 วัน จากนั้นเลอก
ี้
ื้
โคโลนีของเชื้อแบคทีเรียที่เจริญมีเลือกแตะโคโลนีเดี่ยวน ามาเลยงบนอาหารจนได้เชื้อบริสุทธิ์ เก็บรักษาเชอ
บริสุทธิ์โดยเลยงเชื้อบนอาหารเลี้ยงเชื้อ บ่มเชื้อไว้ที่อุณหภูมิห้อง 24-48 ชั่วโมง เขี่ยเชื้อ 1 ลูปเต็มละลายใน
ี้
น้ ากรองนึ่งฆ่าเชื้อ ปริมาตร 1 มิลลิลิตร เก็บที่อุณหภูมิห้อง เก็บเชื้อบนอาหารเอียงเททับด้วยพาราฟินเหลว
ี
์
ย้อมแกรมศึกษาแบคทเรียย้อมสี สีจะติดตามผนังเซลลท าให้เห็นความแตกต่างระหว่างเซลล์แบคทีเรียชนิด
่
ี
ี่
ิ้
้
่
่
ตาง ๆ ได โดยน าแบคทเรียมาเกลยบนแผนสไลดทงไว้ให้แห้ง น าไปผานเปลวไฟ 2-3 ครั้ง เพื่อตรึง
์
่
้
แบคทเรียให้ตดกับแผนสไลด หยดส Crystal violet ลงให้ทวมทงไว้ 30 วินาท ลางออกดวยน้ ากลน หยด
ั่
ิ้
ี
้
ิ
่
ี
์
ี
สารละลายไอโอดีน ทิ้งไว้ 30 วินาที ล้างออกด้วยน้ ากลั่น ล้างสีออกด้วยแอลกอฮอล์ 95เปอร์เซนต์ประมาณ
ี
้
์
ั่
้
้
ั่
20 วินาท ลางออกดวยน้ ากลน ย้อมดวยส Safranin O ทงไว้ 30 วินาท ลางออกดวยน้ ากลน ซับสไลดให้
ี
้
ิ้
้
ี
ิ
ี
ุ
แห้ง น าไปสองดแกรมแบคทเรียภายใตกลองจลทรรศน์ แบคทเรีย แกรมบวกจะย้อมตดสน้ าเงินของ
้
ี
่
ู
ี
้
Crystal violet และแบคทีเรียแกรมลบจะย้อมติดสีแดง Safranin O
2. การสกัดดีเอ็นเอ
ี
2.1 การสกัดดีเอ็นเอแบคทเรีย : สกัดดีเอ็นเอจากโคโลนีของเชอแบคทเรียที่แยกจากตัวอย่างอ้อย
ี
ื้
ด้วยชุดสกัดส าเร็จรูป NucleoSpin Tissue (MACHEREY-NAGEL, Germany) ตรวจพิสูจน์ชนิดของเชื้อใน
ตัวอย่างแต่ละอาการด้วยการตรวจล าดับนิวคลีโอไทด์ต าแหน่ง 16S-23S rDNA
2.2 การสกัดดีเอ็นเอพืช : ตัวอย่างใบสดจากอ้อยทแสดงอาการและไม่แสดงอาการทส ารวจไดจาก
ี่
้
ี่
ี
ั
้
่
แหลงระบาดของโรคในจงหวัดขอนแก่น นครราชสมา และก าแพงเพชร สกัดดเอ็นเอจากใบดวยการ
ี
ี
ประยุกต์ CTAB method ตามวิธีของ Li and Midmore (1999) ตรวจวัดปริมาณและคณภาพดเอ็นเอพืช
ุ
ด้วย Nano drop (Nano Drop Lite Spectrophotometer, Thermo Scientific, USA) ตรวจพิสูจน์ชนิด
ของเชื้อในตัวอย่างแต่ละอาการด้วยการตรวจล าดับนิวคลีโอไทด์ต าแหน่ง 16S-23S rDNA
3. การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ และวิเคราะห์ล าดับนิวคลีโอไทด ์
ท าการเพิ่มปริมาณชนดีเอ็นเอด้วยเทคนิค PCR โดยแต่ละปฏิกิริยามีปริมาตรสทธิ 15 µl มีความ
ิ้
ุ
้
เข้มข้นสุดทายของส่วนผสมดังนี้ 1X PCR buffer, 1.5 mM MgCl , 0.2 mM dNTP, 0.1 U Taq
2
polymerase, 0.34 µM Primer และ 25 ng/µl สารละลายดีเอ็นเอที่สกัดได้แล้วน าไปท าปฏิกิริยาใน
เครื่อง เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ (Veriti Thermal Cycler, USA) มีขั้นตอนดังนี้ Pre-denaturing 94 °C นาน
5 นาท, denaturing 94 °C นาน 1 นาท, annealing 50 °C นาน 1 นาท, extension 72 °C นาน 1 นาท ี
ี
ี
ี