Page 446 - เอกสารประกอบการประชุมวิชาการ ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น ประจำปี 2563 เล่มที่ 1

441

(ท าซ้ า denaturing, annealing และ extension จ านวน 35 รอบ) และ final extension 72 °C นาน 7

ิ
นาที น าผลผลต PCR มาตรวจสอบด้วยวิธี agarose gel electrophoresis และน ามาทาให้ผลผลิต PCR

ุ
บริสุทธิ์ด้วยชุดน้ ายาส าเร็จรูป GF-1 AmpbiClean Kit (Vivantis, Vivantis) ส่งผลผลิต PCR บริสทธิ์ไปหา
ล าดับนิวคลีโอไทด์โดย Solegent (Korea)

4. การสร้าง Phylogenetic tree
์
ั

ั
ี
ทาการจดลาดบนิวคลโอไทดให้ถูกต้องด้วยโปรแกรม BioEdit v 7.1 และ Clustal W จากนั้นทาการ

สร้าง phylogenetic tree ด้วยโปรแกรม MEGA ver. 5.05 ด้วยวิธี Neighbor-Joining โดยใช้โมเดล Kimura
2- parameter ด้วยการสุ่มข้อมูล (bootstrap) จ านวน 1,000 ครั้ง
5. การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยวิธี Real-time PCR และการวิเคราะห์ HRM
ี
ิ้
้
น าสารละลายดเอ็นเอ (25 ng/µl) ทสกัดไดมาเป็นตนแบบในการเพิ่มปริมาณชนเอ็นเอ โดยใชไพร
ี่
้
้
ิ
ี่

เมอร์ 16S-23S ทาปฏิกิริยาเพิ่มปริมาณดเอ็นเอตามข้อ 2 จากนั้น น าผลผลตทไดมาเจอจางอัตราสวน 1:200
ี
ื
้
่
ี
่
ั
ุ
้

สาหรับเป็นดเอ็นเอตนแบบในทา PCR ปริมาตรสทธิ 15 µl ซึ่งมีสวนผสมของปฏิกิริยาดงนี้ 1X PCR buffer,
2.0 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTP, 0.1 U Taq polymerase 0.2 µM p210-R (5’GAGGAAIGIGGAIGACGT3’)/p1370
F(5’AGICCCGIGAACGTATTCAC3’) และ 3.34 µM Syto9 dye วิเคราะห์คาการคลายเกลยวของสายดเอ็น
ี
่
ี
ี่
เอ (melting temperature; Tm) ทตดตงอยู่ในเครื่องเพิ่ม ปริมาณสารพันธุกรรมในสภาพจริง (Light
ั้
ิ
Cycler® 480 Real-time PCR, Roche, Germany) มีขั้นตอนดงนี้ initial-denaturing 94 °C นาน 5 นาท,
ี
ั
ี
denaturing 94 °C นาน 30 วินาท, annealing 50 °C นาน 30 วินาท, extension 72 °C นาน 40 วินาท ี
ี

(ทาซ้ า denaturing, annealing และ extension จานวน 40 รอบ) จากนั้นทาการ เพิ่มอุณหภูมิตงแต 65 °C

่
ั้

ถึง 95 °C โดยเพิ่ม 0.03 °C ต่อวินาที เมื่อสนสุดให้ลดอุณหภูมิลงที่ 40° C นาน 30 วินาท วิเคราะห์ melting
ี
ิ้
peak ดวยโปรแกรม Tm calling และสร้าง Normalized melting curves โดยโปรแกรม Gene Scanning
้
1.5.0 (Roche Diagnostics, Germany)

ผลและวิจารณ์ผลการทดลอง
1. การจัดกลุ่มเชื อแบคทีเรียในอ้อย
ี
การย้อมแกรมแบคทีเรียสามารถแบ่งกลุ่มแบคทีเรีย เป็น 2 กลุ่ม จากลักษณะการติดสีแกรมแบคทเรีย
กลมท 1 คอ แบคทเรียแกรมลบ Sphinggomonas paucimobilis, Pseudomonas oryzihabitans,
ี
ุ่
ี่
ื
Pantoea stewartii, Curtobacterium sp., Acinetobacter radioresistens, Entrobacter sp. และ
้
ี่
ี
ุ่
ื
Acinetobacter radioresistens กลมท 2 คอ แบคทเรียแกรมบวก ไดแก่ Bacillus pumilus, และ
Streptomyces spp. (ภาพที่ 1)

การทาปฏิกิริยา PCR และการวิเคราะห์ลาดบนิวคลโอไทด พบว่ามีขนาดความยาวของชนยีน 1,000
ี
์
ิ้
ั
้
ุ่
ั
ี่
ี่
ั
bp (ภาพท 2) เมื่อน ามาสร้าง Phylogenetic tree (ภาพท 3) พบว่าสามารถจดกลมตวอย่าง ไดเป็น 2 กลม
ุ่
ุ่
ี่
ุ่
คอ กลมท 1 เป็นกลมของเชอแบคทเรียแกรมลบ ไดแก่ Sphinggomonas paucimobilis, Pseudomonas
้
ี
ื้
ื
oryzihabitans, Pantoea stewartii, Curtobacterium sp., Acinetobacter radioresistens,