Page 447 - เอกสารประกอบการประชุมวิชาการ ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น ประจำปี 2563 เล่มที่ 1

442

Entrobacter sp. และ Acinetobacter radioresistens กลุ่มที่ 2 เป็นกลุ่มของเชื้อแบคทีเรียแกรมบวกและ

้
ไฟโตพลาสมา ไดแก่ Bacillus pumilus, Streptomyces spp. และ Sugarcane white leaf เมื่อพิจารณา
ั
ื้
้
ี
ื้
คาความเหมือน (% similarity) พบว่า เชอแบคทเรียและเชอไฟโตพลาสมา มีระดบความคลายคลง 95-99%
่
ึ
ี
ั

ี
ื้
ตามลาดบ พบว่าเชอไฟโตพลาสมามีวิวัฒนาการมาจากแบคทเรีย บรรพบุรุษเป็นแบคทเรียแกรมบวกอยู่ใน
คลาสเดียวกับเชื้อ Bacillus sp. ท าให้เชื้อทั้งสองมีความคล้ายคลึงกัน (Chen et al. 2012)
2. การจ าแนกเชื อแบคทีเรียด้วยวิธี HRM
ผลการทาปฏิกิริยา PCR ดวยไพรเมอร์ HRM p210-R / HRM p1370-F จากตวอย่างจานวน 96
้

ั
ตวอย่าง มีทงแสดงและไม่แสดงอาการจากการตดเชอ มาวิเคราะห์คาการคลายเกลยวของสายดเอ็นเอ
ี
ั
ี
ิ
ื้
ั้
่
้
ุ่
้
ื้
ี่
ี่
่
(melting temperature; Tm) ดวยโปรแกรม Tm calling ไดคาเฉลย Tm (ภาพท 4) แบ่งเป็น 6 กลมเชอ
ุ่
ื
ี่
ั
่
ื้
ดงนี้ กลมท 1 คา คอ เชอ Pantoea stewatii, Sphinggomonas paucimobilis และ Pseudomonas
oryzihabitans มีคา Tm 85.01 C จานวน 5 ตวอย่าง Bacillus mycoides มีคา Tm 85.01 C จานวน 3
๐
่

่
ั

๐
ตวอย่าง กลมท 2 คอ Sugarcane white leaf มีคา Tm 85.84 C จานวน 13 ตวอย่าง กลมท 3 คอ
ื
ี่

ุ่
ั
๐
ื
ั
ี่
ุ่
่
Bacillus pumilus มีคา Tm 85.84 C จานวน 8 ตวอย่าง กับ Curtobacterium sp. มีคา Tm 85.84 C
๐
๐
ั
่

่

ั
ื้
๐
่
ุ่
ุ่

ั
ี่
ี่
ื
จานวน 6 ตวอย่าง กลมท 4 คอ เชอ Streptomyces sp. มีคา Tm 86.04 C จานวน 14 ตวอย่าง กลมท 5
่
ื
ุ่
ื้
๐
ั
คอ เชอ Acinetobacter radioresistens มีคา Tm 86.33 C จานวน 16 ตวอย่าง และ กลมท 6 คอ เชอ
ี่
ื้

ื
Enterobacter sp. มีค่า Tm 87.64 จ านวน 31 ตัวอย่าง พบว่าภายในกลุ่มที่ 1 และ 3 มีค่า Tm ใกล้เคียงกัน
ี
มากไม่สามารถแยกออก การจาแนกความแตกตางของจโนไทป์ จากการสร้างกราฟ Normalized melting

่
ื้
ุ
ี่
curve ดวยโปรแกรม Gene Scanning (ภาพท 2) พบว่าสามารถแยกเชอแบคทเรียจากเชอบริสทธิ์ ออกเป็น
ื้
้
ี
ั
ุ่
ั
8 กลม อย่างชดเจนดงนี้ 1) Enterobacter sp. 2) Bacillus subtilis 3) Pseudomonas oryzihabitans
4) Acinetobacter radioresistens 5) Pantoea stewartii 6) Sphinggomonas paucimobilis 7)
่
ี่
Sugarcane white leaf และ 8) Curtobacterium sp. (ภาพท 5 และ 6) สวนตวอย่างอ้อย สามารถแยก
ั
ุ่
เชอแบคทเรีย ออกเป็น 8 กลม อย่างชดเจนดงนี้ 1) Streptomyces spp. 2) Bacillus pumilus 3)
ั
ี
ั
ื้
Entrobacter sp. 4) Acinetobacter radioresistens 5) Pantoea stewartii 6) Bacillus mycoides 7)
ื้

Curtobacterium sp. และ 8) Sugarcane white leaf ดังนั้นการใช้วิธี HRM สามารถตรวจและจาแนกเชอ
้
แบคทีเรียที่มีอาการและไม่แสดงอาการได โดยไม่ต้องวิเคราะห์ล าดับนิวคลีโอไทด์เพื่อพิสูจน์ชนิดของเชื้อ ท าให้
ี
ื้
ี่

แก้ปัญหาเรื่องการจาแนกอาการโรคอ้อย โดยเฉพาะโรคทเกิดจากเชอแบคทเรียและไฟโตพลาสมา ซึ่งมี
้
ิ
ั
ี่
้
้

้
ลกษณะทคลายกันออกจากกันได มีรายงานการวิจยใช เทคนิค PCR และวิเคราะห์ผลผลตดวย HRM ทาให้
ั
ื้
้
สามารถแยกจโนไทป์ ของเชอ Mycoplasma gallisepticum 30 ไอโซเลทไดอย่างรวดเร็ว (Seyed et al.,
ี
2010 และ ธีรวุฒิ และคณะ, 2559) ไดใช้วิธีการวิเคราะห์ HRM เพื่อแยกความแตกต่างของเชื้อไฟโตพลาสมา
้
ุ่
้
ุ่
้
สาเหตของโรคอ้อย พบว่า สามารถแยกเชอได 3 กลม ไดแก่ กลมเชอไฟโตพลาสมาโรคใบขาว ใบขาวกอฝอย
ุ
ื้
ื้
้
้
และกอตะไคร้ Choochai et al. (2013) ไดพัฒนาวิธีการตรวจสนิป rs5896 ของยีน prothrombin ดวยวิธี
PCR และ HRM โดยใชตวอย่างประชากรจงหวัดขอนแก่นททราบจโนไทป์แลวน ามาเพิ่มปริมาณดวยวิธี PCR
้
้
ั
ั
้
ี่
ี
และวิเคราะห์ดวยวิธี HRM ผลการทดลองสามารถแยกความแตกตางระหว่างจโนไทป์ตาง ๆ ได สาหรับการ
่
่

้
ี
้