Page 415 - เอกสารประกอบการประชุมวิชาการ ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น ประจำปี 2563 เล่มที่ 1

410

ี
การพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุลใหม่และวิธการตรวจเชื อโรคใบขาวด้วยเทคนิค M13-tagged
two steps- PCR ที่แม่นย าและมีความไวสูง

A new molecular marker and efficient M13-tagged two steps- PCR detection

technique for sugarcane white leaf disease

ศุจิรัตน์ สงวนรังศิริกุล วีรกรณ์ แสงไสย เบญจวรรณ รัตวัต จุฑามาศ สอนเมือง
1
1
1
์
1
1
และรวีวรรณ เชื้อกิตติศักด
ิ์

รายงานความก้าวหน้า

ในงานวิจยนี้ ไดทาการพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุลใหม่ สาหรับใชในการตรวจโรคใบขาวอ้อยดวย
้

้
ั
้
เทคนิค M13-tagged two-steps-PCR และเครื่องหมายโมเลกุลในการตรวจยีน Immunodominant
ั้
protein (IMP) รวมทงมีการทดลองพัฒนาเทคนิคอื่นเพิ่มเตมทง่ายและรวดเร็ว ไดแก่ Loop-Mediated
ี่
ิ
้
isothermal amplification (LAMP) และ multiplex PCR เพื่อการทดสอบเบื้องตน ในการพัฒนาวิธีการ
้

้
ตรวจเชอโรคใบขาวดวยเทคนิค M13-tagged two steps- PCR ไดพัฒนาไพร์เมอร์ชนิดใหม่ในตาแหน่ง
้
ื้
16S rRNA และ 23S rRNA ของเชื้อไฟโตพลาสมาในอ้อย ทดสอบสภาวะในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยการ
ี
ี่
ั
ปรับความเข้มข้นของไพร์เมอร์ และจ านวนรอบในการเพิ่มปริมาณดเอ็นเอ สามารถพัฒนาวิธีการทตรวจจบ

ู่
แถบดีเอ็นเอเป้าหมายได้ชัดเจนจานวน 2 แถบ ขนาดประมาณ 600 และ 300 คเบส ผลการเปรียบเทียบกับ
วิธี nested-PCR พบว่ามีความจาเพาะตอดเอ็นเอเป้าหมายไดมากกว่า การตรวจพิสจน์แถบดเอ็นเอทได ้
ี
ี่
่
ี
้

ู
พบว่า ตรงกับต าแหน่งของยีนเป้าหมายของเชื้อไฟโตพลาสมา การทดสอบในตัวอย่างที่ติดเชื้อหลายชนิด ยัง
พบแถบดีเอ็นเอเพิ่มขึ้น 1 ต าแหน่ง อยู่ระหว่างการวิเคราะห์และแก้ไขวิธีการ การพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุล
ใหม่ด้วยยีน Imp ท าการทดสอบไพร์เมอร์จ านวน 3 คู่ไพร์เมอร์ และคัดเลือกได้ 1 คู่ (Imp1) ผลผลิตมีขนาด
1250 คู่เบส น ามาตรวจล าดับเบส และออกแบบไพร์เมอร์ใหม่ จ านวน 1 คู่ ผลผลิตขนาด 800 คู่เบส (Imp2)
ั้
น ามาตรวจในอ้อยทตดเชอไฟโตพลาสมาทง 3 ชนิด พบว่าสามารถตรวจพบดเอ็นเอชดเจน และมี
ี่
ั
ื้
ี
ิ
ความจ าเพาะต่อเชื้อไฟโตพลาสมาในอ้อย น าผลวิเคราะห์ล าดับนิวคลีโอไทด์ของดีเอ็นเอขนาดประมาณ 800
ี

เบสที่ได้มา เปรียบเทียบกับลาดับนิวคลโอไทดที่มีอยู่ในฐานข้อมูลสากล พบว่ามีความเหมือนกับโปรตีนของ
์

ี่
้
เชอไฟโตพลาสมาในอ้อย 80 เปอร์เซ็นต ทาการออกแบบไพรเมอร์ (Imp 3) ทมีความจาเพาะเพื่อใชในการ
ื้
์

้
ู่
ตรวจหาเชอไฟโตพลาสมาทง 3 ชนิด จากขนาด 800 คเบส ให้ไดดเอ็นเอขนาด 310 คเบส น าไปทาการ
ี
ั้
ื้
ู่
ทดสอบตรวจเชอไฟโตพลาสมาทง 3 ชนิด พบว่าสามารถตรวจจบดเอ็นเอของเชอไฟโตพลาสมาในอ้อยได ้
ั
ื้
ี
ั้
ื้
ี
ผลการตรวจล าดับนิวคลิโอไทด์ของดเอ็นเอ 310 คู่เบสนี้ พบว่าเป็นโปรตีนของไฟโตพลาสมาในอ้อย ที่ความ
่
่
์
ั

เหมือนระดบ 80 เปอร์เซ็นต การจาแนกความแตกตางของ Imp ของเชอทง 3 ชนิดพบว่ามีความแตกตาง
ั้
ื้
ี่
กัน โดยพบว่า SCWL และ SCGS มีความสัมพันธ์ใกล้ชิดกันมากทสด มีค่าความต่างกันที่ 1.64 และตัวอย่าง
ุ
ั
จาก SCGGS และ SCWL มี ความสมพันธ์ทแตกตางกันมากทสด ซึ่งมีคาความตางกันท 4.82 การ
่
ี่
ุ
่
ี่
ี่
่

1 ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น สถาบันวิจัยพืชไร่และพืชทดแทนพลังงาน