Page 419 - เอกสารประกอบการประชุมวิชาการ ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น ประจำปี 2563 เล่มที่ 1

414

ผลการทดลองและวิจารณ์

การพัฒนาวิธีการตรวจเชื อโรคใบขาวด้วยเทคนิค M13-tagged two steps- PCR
ี่
ั่
จุดเดนของเทคนิค nested PCR ทต่างจาก PCR ทวไป คือเป็นการเพิ่มความไว (sensitivity) และ
่
ความจ าเพาะ (specificity) ในการเพิ่มจ านวนและการตรวจสอบดีเอ็นเอบริเวณที่ต้องการศึกษา แต่มีปัญหา
ู

ี่
ู้
ี
ของระยะเวลา และการปนเปื้อนแบบ carried over สงมาก ในกรณทผดาเนินการไม่มีประสบการณ ์
ิ
ี่
เนื่องจากใชผลผลต PCR ทไดจากขั้นท 1 มาเพิ่มปริมาณตออีกในขั้นท 2 ดงนั้นการลดขั้นตอน PCR ลงให้
้
้
ั
่
ี่
ี่
ื
่
้
ึ
ี
เหลอขั้นเดยวจงเป็นแนวทางในการแก้ปัญหานี้ การออกแบบไพร์เมอร์ชนิดใหม่ไดน าสวนของ M13 มาใช ้
ื่
ิ

ิ

เชอมตดกับไพร์เมอร์เดม (MLO-X, MLO-Y และ P1, P2) ทาการออกแบบไพรเมอร์สาหรับ M13 ดวย
้
ื้
โปรแกรม Clustalx2 หลังจากนั้นท าการทดสอบปฏิกิริยาในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเป้าหมายเบองต้น โดย
ิ
่
สวนประกอบในปฏิกิริยาพีซีอาร์ 15 ไมโครลตรตอหนึ่งหน่วยตวอย่าง มีดงนี้ 1X PCR buffer A (500mM
่
ั
ั
KCl, 100mM Tris-HCl, 0.1% Triton™ X-100; Vivantis), 0.2 µM dNTP 1.5 U Taq DNA polymerase
(Vivantis) ไพรเมอร์ความเข้มข้น 0.5 µM สงเคราะห์ดเอ็นเอในเครื่องพีซีอาร์ ก าหนดการเปลยนแปลง
ั
ี่
ี
ี่
ี่
ี่
ี
ี่
ั
อุณหภูมิตามเวลาดงตอไปนี้ ขั้นท 1 ทอุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 3 นาท ขั้นท 2 ทอุณหภูมิ 95
่
องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 วินาท ทอุณหภูมิ 58 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 40 วินาท และ ทอุณหภูมิ 72
ี
ี่
ี
ี่

ี่
ี่

ี
องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1นาท 30 วินาท โดยทาซ้ าขั้นตอนท 2 จานวน 20 รอบ ขั้นท 3 ทอุณหภูมิ 95
ี
ี่
ี่
ี่
ี
องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 วินาท ทอุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 40 วินาท และ ทอุณหภูมิ 72
ี
ี่

ี่
ี

ี
ี่
องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1นาท 30 วินาท โดยทาซ้ าขั้นตอนท 3 จานวน 20 รอบ ขั้นท 4 ทอุณหภูมิ 72
ี
ี่
องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาท และที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที แล้วท าการปรับเปลยน
สภาวะเพื่อให้ได้ผลผลิตพีซีอาร์ที่ชัดเจน
ี่
ี่
ผลการทดลองปรับเปลยนสภาวะในการทาปฏิกิริยาโดยปรับเปลยนความเข้มข้นของไพร์เมอร์

จ านวนรอบในการเพิ่มปริมาณและอุณหภูมิในการเกาะติดไพร์เมอร์ ด าเนินการจ านวน 10 แบบ พบว่าแบบ
ที่ท าให้ได้ดีเอ็นเอเป้าหมายที่ชัดเจน 2 ต าแหน่ง ที่ประมาณ 200 และ 500 คู่เบส และมีปฏิกิริยาและสภาวะ
ที่เหมาะสมในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ คือแบบที่ 6 (ตารางที่ 1 และ ภาพที่ 1)

ตารางที่ 1 ส่วนประกอบและสภาวะในการท าปฏกิริยา M13-tagged two steps- PCR
ิ
สารเคม ี ปริมาตร (µL) ความเข้มข้นสุดท้าย PCR conditions
Nuclease-free water 6.6 -
10X Taq buffer 1.5 1X 94°C 3 min
25 mM MgCl 2 0.9 2 mM 94 °C 30 s
2.5 mMdNTP 1.2 0.2 mM 65 °C 30 s
10 µM PrimerF 0.15 0.1 µM 72 °C 40 s
10 µM PrimerR 0.15 0.1 µM  20 cycles
Taq DNA polymerase 0.3 1 U 94 °C 30 s
DNA template 3 75 ng 62 °C 30 s
Total 15 - 72 °C 40 s
 15 cycles