Page 417 - เอกสารประกอบการประชุมวิชาการ ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น ประจำปี 2563 เล่มที่ 1
P. 417
412
ั
ี่
ึ
้
ู
้
ดงนั้นการตรวจเชอจงตองตรวจจากเนื้อเยื่อพืช และวิธีตรวจตองเป็นวิธีทมีความแม่นย า และมีความไวสง
ื้
ื้
้
ื้
ุ
สามารถตรวจเชอในปริมาณตามากได ในปัจจบันการตรวจหาเชอไฟโตพลาสมาในเนื้อเยื่อพืชนิยมใชวิธี
้
่
nested-PCR หรือ semi-nested-PCR ซึ่งเป็นวิธีการทตองทาปฏิกิริยาพีซีอาร์เพื่อเพิ่มปริมาณดเอ็นเอ
ี
ี่
้
้
เป้าหมายให้มากขึ้นถึง 2 ครั้ง แต่ละครั้งมีการใชเครื่องหมายโมเลกุลอย่างละชดแตกต่างกัน ปัญหาที่สาคญ
ุ
ั
ของเทคนิคดงกลาวนี้ คอ การปนเปื้อนชนิด carried-over ซึ่งเกิดจากการปนเปื้อนทเกิดขึ้นในพีซีอาร์ชุดท ี่
่
ื
ั
ี่
หนึ่ง แลวถูกมาขยายเพิ่มปริมาณอีกในพีซีอาร์ชดทสอง ทาให้เกิดการแปลผลทผดพลาด ทมักเป็นชนิด
ี่
้
ี่
ิ
ุ
ี่
้
ี่
ี่
“ผลบวกปลอม” (false positive) นอกจากนี้ยังเป็นปัญหาในเรื่องของเวลาทตองใชในการตรวจผลทอาจ
้
้
ั
ึ
ั
้
้
้
ตองใชเวลานานกว่า 1 สปดาห์อีกดวย ดงนั้นจงมีการน าเทคนิค Realtime PCR มาใชในการตรวจผลแทน
การใช้ Conventional PCR ท าให้ติดตามผลการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้ตามปฏิกิริยาทเกิดขึ้นจริงในขณะนั้น
ี่
้
สามารถรู้ผลไดภายในหนึ่งวัน แม้เป็นเครื่องมือทมีประสทธิภาพในดานการย่นเวลาการตรวจผล แต ่
ิ
ี่
้
ประสิทธิภาพด้านความไวของเครื่องมือเทียบเท่ากับเทคนิคอิเลคโตรโฟริซิส (ศุจิรัตน์ และคณะ, 2558) และ
ปัญหาที่ส าคัญของวิธีการนี้คือเครื่องมือที่ใช้ราคาแพงมาก รวมไปถึงชุดน้ ายา และอุปกรณ์ประกอบอื่นที่ต้อง
เฉพาะส าหรับเครื่องและรุ่นของเครื่องมือนั้นๆ ท าให้จ ากัดเฉพาะกลุ่มห้องปฏิบัติการที่มีงบประมาณเพียงพอ
ู้
ึ
่
ี่
้
ู้
ั้
เทานั้น อีกทงผใชงานยังจากัดเฉพาะผทมีความช านาญกับการใชเครื่องมือนี้เทานั้น จงมีความจากัดมากขึ้น
้
่
ุ
ั
ี่
ึ
ไปอีก จงเป็นสาเหตสาคญททาให้การตรวจโรคใบขาวไม่เป็นทแพร่หลายและ มีหน่วยตรวจคดกรองโรคใบ
ี่
ั
ขาวจ านวนน้อยมากในประเทศไทย ไม่เพียงพอต่อการคัดกรองยับยั้งการระบาดของโรค
้
ื
ยีนเป้าหมายทนิยมใชในการตรวจเชอไฟโตพลาสมาโรคใบขาวอ้อยและไฟโตพลาสมาชนิดอื่น คอ
ื้
ี่
ี
ื้
้
่
้
ยีน 16S-23S rDNA ซึ่งนิยมใชในการตรวจจาแนกเชอแบคทเรียหลายชนิดดวยเชนกัน มีรายงานการใช ้
เครื่องหมายโมเลกุลหลายชนิดในการตรวจจับบริเวณต าแหน่งยีนนี้ ในจ านวนนี้ มีรายงานการออกแบบไพร
ุ
้
1
เมอร์ชด MLO-X/ MLO-Y และ P / P2 สาหรับใชตรวจโรคใบขาวอ้อยดวยเทคนิค nested-PCR
้
(Hanboonsong, 2006) แม้มีรายงานว่าเครื่องหมายโมเลกุลชดนี้มีความจาเพาะตอโรคใบขาวอ้อย แตผล
่
่
ุ
้
ี
้
้
ึ
ึ
ุ
ื้
จากการศกษาพบว่าเครื่องหมายโมเลกุลชดนี้สามารถตรวจพบเชอแบคทเรียชนิดอื่นไดดวย จงไดพัฒนา
เครื่องหมายโมเลกุลชุดใหม่ ที่มีความจ าเพาะต่อการตรวจจับยีน secA ของเชื้อไฟโตพลาสมาโรคใบขาวอ้อย
(ศุจิรัตน์ และคณะ, 2556) และน ามาใช้ในการตรวจโรคใบขาวอ้อยร่วมกับการตรวจยีน 16S-23S rDNA แต ่
เนื่องจากวิธีการตรวจยีน secA ที่พัฒนาขึ้นใหม่นี้ ใช้เทคนิค PCR ซึ่งใช้ปฏิกิริยาพีซีอาร์เพียงครั้งเดียว จึงท า
ให้มีความไวน้อยกว่าการตรวจดวย nested-PCR ซึ่งมีการทาปฏิกิริยาพีซีอาร์ถึง 2 ครั้ง แตลดปัญหาการ
่
้
ุ
ปนเปื้อน และเพิ่มความแม่นย ามากขึ้น การตรวจโรคใบขาวของอ้อยของศนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น ปัจจบันมี
ู
การตรวจยีนทั้ง 2 ต าแหน่งด้วยทั้ง 2 วิธีการ เพื่อการยืนยันผล ซึ่งใช้เวลาในการตรวจประมาณ 1 สัปดาห์จึง
์
ั
้
ั
้
จะรู้ผลได หากมีตวอย่างเป็นจานวนมาก จะใชเวลานานยิ่งขึ้นไปอีก ดงนั้นวัตถุประสงคในงานวิจัยนี้ได้แก่
การพัฒนาวิธีการตรวจโรคใบขาวใหม่ ด้วยเทคนิค M13-tagged two steps- PCR ที่มีความแม่นย า มีความ
้
้
ื้
ี่
ี่
ไวสง ใชงานง่าย ราคาไม่แพง สาหรับการใชงานทตองการความไวในการตรวจเชอทสง สามารถตรวจเชอ
ื้
ู
้
ู
้
ี่
่
ปริมาณตามากไดในเวลาทรวดเร็ว สาหรับทดแทนวิธี nested-PCR เดม และเครื่องหมายโมเลกุลสาหรับ
ิ
