Page 427 - เอกสารประกอบการประชุมวิชาการ ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น ประจำปี 2563 เล่มที่ 1

422

complementary กัน และเมื่อน าไปท า PCR จะให้ผลผลิตที่มีขนาดความยาวที่แตกต่างกัน การท า m-PCR

ต้องปรับสภาวะพอเหมาะของปฏิกิริยา เพื่อให้สามารถเพิ่มขยายจ านวนดีเอ็นเอจากทุก primer ที่ใส่ลงไปได ้
เท่ากันและเนื่องจากในปฏิกิริยานี้จะมี primer หลายคู่และเมื่อใช้ primer เพิ่มขึ้นส่งผลให้เกิดการรบกวนใน

ปฏิกิริยามากขึ้นจึงท าให้การปรับสภาวะเพื่อให้เหมาะสมที่สุดยิ่งยากไปด้วย (Forbes et al., 2002)

การออกแบบ primer ใหม่ : ทาการออกแบบไพรเมอร์ดวยโปรแกรม ClustalX (version 2.0)

้
ั
ู่

ี่
MultiplexI ประกอบดวย 3 คไพรเมอร์ มีขนาดอยู่ท 322, 262 และ 136 bp ตามลาดบการทดสอบ
้
เครื่องหมายโมเลกุลชนิด mPCR พบว่าสามารถแยกชนิดของเชื้อได ้

ภาพที่ 8 ผลจากการสังเคราะห์ดีเอ็นเอด้วย Multiplex PCR (m-PCR) SCWL,SCGS,SCGGS ในตัวอย่าง

อ้อย (1-2): ขาว (3-4) : ใบเขียว (5-6) : ใบขาวปนเขียว (7-8) : ขาว (9-10) :ใบเขียว (11-12): ใบขาว
ปนเขียว

การพัฒนาวิธีตรวจหาเชื อไฟโตพลาสมาโรคใบขาวอ้อยด้วยไพรเมอร์ Multiplex โดยใช้ real-
time PCR :

ี่

็
้
ใช primer ชด Multiplex ทประกอบดวย (SCWL, SCGS, SCGS) โดยเพิ่มปริมาณเปนจานวน 45
้
ุ
รอบ แต่ละรอบประกอบดวยช่วง pre-incubation ที่อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาท 1 รอบ,
ี
้
่
ี่
ตามดวย 40 รอบ ของชวง amplification ทอุณหภูมิ 95องศาเซลเซียส, ชวง melting curve ทอุณหภูมิ
่
้
ี่
ี
95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาท1 รอบและชวง cooling ทอุณหภูมิ 40องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30
ี่
่
ื้
้
วินาทีได้ผลดังภาพที่ 9 และ 10 สามารถแยกเชอไฟโตพลาสมาด้วยชดไพรเมอร์ Multiplex ที่ประกอบดวย
ุ
(SCWL, SCGS, SCGS) ได้ด้วย Tm ต่างกัน เชื้อใบขาว SCWL Tm 77.48 C เชื้อใบขาวปนเขียว SCGS Tm
75.53 C และเชื้อใบเขียว SCGSTm 79.13 C