Page 430 - เอกสารประกอบการประชุมวิชาการ ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น ประจำปี 2563 เล่มที่ 1

425

การพัฒนาเทคนิค LAMP ด้วยไพร์เมอร์ groEL

ทาการออกแบบไพร์เมอร์สาหรับ LAMP ในการตรวจจบยีน groEL จากเชอ Sugarcane white
ื้
ั

ึ
leaf phytoplasma molecular chaperonin GroEL gene, ศกษาปฏิกิริยา LAMP โดยใชน้ ายาสาเร็จรูป

้
LavaLamp DNA Master Mix (Lucigen) ในตัวอย่างอ้อยใบขาวที่มีความเข้มข้น (15ng) โดยมีส่วนประกอบ
้
ั
ดงนี้ LavaLamp DNA Master Mix (1x) Green Fluoresent Dye (0.1X) ไพรเมอร์ประกอบดวย final
ื
concentration คอ 0.2 µM Outer primer (F3, B3), 1.6 µM Inner primer (FIP, BIP), 0.4 µM loop
primer (Loop F and R) บ่ม 65 องศา นาน 60 นาทีโดยใช้เครื่อง KANEKA พบว่าสามารถเกิดปฏิกิริยาได ้
และสามารถตรวจดีเอ็นเอได้ในระดับการเจือจางถึง 10 จากดีเอ็นเอตั้งต้น (ภาพที่ 12)
-11

ี่
-2
ี
ภาพที่ 12 ระดับความเข้มข้นของดเอ็นเอทสามารถตรวจด้วยเทคนิค LAMP No.1-7 (1,10 ,10 ,10 , 10 -
-4
-6
-10
-11
8 , 10 ,10 ) ตามล าดับ ใช้ตัวอย่างอ้อยใบขาว No.8 เป็น negative control โดยใช้น้ า

ผลการตรวจความไวของปฏิกิริยา LAMP เทียบกับ nested-PCR
้
ื้
ี่
ี
พบว่าระดบความเข้มข้นของปริมาณดเอ็นเอของเชอไฟโตพลาสมาทสามารถตรวจดวยเทคนิค
ั
ั
้
ิ
4
LAMP ที่ใช้ groELเป็นไพร์เมอร์ สามารถตรวจจบดีเอ็นเอไดตาสุด 1.89 x10 เซลล์ต่อไมโครลตร แต่พบว่า
่
ี
ความเข้มข้นของดีเอ็นเอที่วัดได้ไม่สอดคล้องกับระดับการเจือจาง ท าให้ต้องทดสอบเพิ่มเพื่อหาปริมาณดเอ็น
เอที่ต่ าที่สุด (ตารางที่ 2)
ความไว (sensitivity) ของวิธีการ LAMP และ Nested-PCR
ื้
้
้
ิ
การทดสอบซ้ าโดยใชดีเอ็นเออ้อยที่ตดเชอ SCWL เจือจาง 10 เท่า จ านวน 10 ระดับ จากเริ่มตนท ี่
-10
ื
10 ถึง 10 พบว่า LAMP สามารถตรวจจบดเอ็นเอเปาหมายไดที่ระดับความเจอจางที่ 10 เช่นเดียวกับ
้
ี
ั
-10
0
้
เทคนิค Nested PCR ในระดับพีซีอาร์ชุดที่สอง ผลผลิตขนาด 210 bp ส่วน Nested-PCR ชุดที่หนึ่ง ผลผลต
ิ
-7
ขนาด 700 bp ตรวจจับระดับความเจือจางได้ต่ าสุดที่ 10 (ตารางที่ 3, ภาพที่ 13)
ื้
ี่
้

ุ
่
การวิเคราะห์จานวน copy number ตาสดของเชอไฟโตพลาสมาทสามารถตรวจจบได ทดสอบ
ั
้
ี่
ิ้
โดยใชพลาสมิดลกผสม pUC1318 ทมีชนยีนขนาด 700 bp น ามาเจอจาง ตรวจวัดความเข้มข้นของพ
ู
ื
ลาสมิดทได และคานวณจานวน copy number ตงตนก่อนทาการตรวจดวยวิธี Nested-PCR ผลการ
ี่
้

้
้

ั้
ทดลองพบว่า วิธี LAMP และ nested-PCR ที่ผลผลิตขนาด 210 bp สามารถตรวจได้ระดับต่ าถึง 1.27X10 -
1 copy/µl ส่วน nested-PCR ที่ผลผลิตขนาด 700 bp ตรวจได้ที่ 2.66X10 copies/µl (ตารางที่ 3)
2