Page 423 - เอกสารประกอบการประชุมวิชาการ ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น ประจำปี 2563 เล่มที่ 1

418

ิ้
ี่
้
การทดสอบตรวจลาดบเบสของชนยีน Imp ทไดพบว่ามีความใกลเคยงกับเชอไฟโตพลาสมาท ี่

ั
ี
ื้
้
ี่
ี
้
ี
ี่
ื้
้
้
ู

ใกลเคยงกัน น าดเอ็นเอทมี 3 เชอ ไดแก่ SCWL,SCGS,SCGGS ทตรวจพิสจน์แลว มาตรวจวิเคราะห์ลาดับ
เบสด้วยไพร์เมอร์ Imp 2 ได้ผลล าดับเบสของ Imp ดังนี้

ล าดับนิวคลีโอไทด์ของยีน IMP ขนาด 800 bp ในอ้อย

น าผลวิเคราะห์ล าดับนิวคลีโอไทด์ของแถบดเอ็นเอขนาดประมาณ 800 เบสที่ได้มาแปลผลเป็นสาย
ี
กรดอะมิโนและเปรียบเทียบกับข้อมูลที่มีอยู่ในฐานข้อมูลของ GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)
ด้วยโปรแกรม Blastn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST) พบว่า มีส่วนที่เหมือนกับ

ี่
hypothetical protein ใน Saccharum 80 เปอร์เซ็นต์ (ภาพท 5)
ั้
ท าการออกแบบไพรเมอร์ (Imp 3) ใหม่ที่มีความจ าเพาะเพื่อใช้ในการตรวจหาเชอไฟโตพลาสมาทง
ื้
3 ชนิด ดวยโปรแกรม Clustalx2 MEGA-X, Tm calculator ซึ่งมีขนาด 310 คเบส น าไปทาการทดสอบ
้

ู่

่
ตรวจเชอไฟโตพลาสมาทง 3 ชนิด โดยมีสวนผสมในการทาปฏิกิริยาและขั้นตอนการเพิ่มปริมาณดเอ็นเอ
ื้
ี
ั้
ั
่
้
ั
ิ
สวนประกอบในปฏิกิริยาพีซีอาร์ 15 ไมโครลตรตอหนึ่งหน่วยตวอย่าง โดยใชไพรเมอร์ IMP มีดงนี้ 1x PCR
่
buffer A (500mM KCl, 100mM Tris-HCl (pH 9.1 at 20°C) and 0.1% Triton™ X-100; Vivantis), 0.2
่
ไมโครโมลาร์ dNTP Taq DNA polymerase (Vivantis) ความเข้มข้น 0.1 หน่วยตอหนึ่งหน่วยปฏิกิริยา
ี่
ไพรเมอร์ ความเข้มข้น 0.5 ไมโครโมลาร์ สงเคราะห์ดเอ็นเอในเครื่องพีซีอาร์ ก าหนดการเปลยนแปลง
ั
ี
่
อุณหภูมิตามเวลาดงตอไปนี้ ขั้นท 1 ทอุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 3 นาท ขั้นท 2 ทอุณหภูมิ 95
ี่
ี่
ี
ั
ี่
ี่
องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 วินาท ทอุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 40 วินาท และ ทอุณหภูมิ 72
ี
ี่
ี่
ี

องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1นาท 30 วินาท โดยทาซ้ าขั้นตอนท 2 จานวน 35 รอบ ขั้นท 3 ทอุณหภูมิ 72
ี
ี่
ี่

ี
ี่
ี
ี
องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาท และทอุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาท สามารถสงเคราะห์ดเอ็นเอ
ี่
ั
ี
ขนาด 310 คู่เบสได้ (ภาพที่ 6)