Page 54 - 55. Baru ok (Repaired)1 - mumu didi.doc

2+
DNA template (Sampel) , Primer Spesifik, Mg , dNTP dan Buffer. PCR Konvensioal biasanya dilakukan
dengan volume total 10-100 µl. Pada bab ini kita akan bahas satu persatu

8.3.1Enzim Taq DNA Polimerase

Enzim taq polymerase merupakan enzim yang di isolasi dari bakteri Thermus aquaticus YT1 yang
bersifat thermofilik (hidup pada lingkungan panas). Penggunaan enzim taq DNA Polimerase yang terlalu
banyak memungkinkan mengenali bagian bagian yang tidak diinginkan sedangkan taq DNA Polimerase yang
tarlalu sedikit membuat DNA menjadi teramplifikasi dalam jumlah yang sedikit.

8.3.2 DNATemplate

DNA template atau DNA cetakan merupakan bahan yang akan lakukan pengujian, pada dunia
kesehatan seringkali disebut dengan sampel. DNA template yang digunakan umumnya adalah DNA genom
yang diperoleh dari Isolasi DNA. Tingkat kemurnian DNA pada proses PCR sangatlah penting. Kemurnian
DNA dapat di uji melalui pengkuran spectrophotometer dengan membandingkan absorbansi A260/A280.
DNA dikatakan murni apabila perbandingan menunjukkan angka 1,8-2,0.

8.3.3 Primer Spesifik
Primer digunakan untuk pengenalain titik/ daerah spesifik pada genom. Untuk mengenali daerah
khusus, biasanya primer yang digunakan antara 18 sampai 30 bp. Primer dirancang dengan system Forward
dan Reverse. Primer Forward melakukan amplifikasi pada Leading Strand, sedangkan Primer Reverse
melakukan amplifikasi pada Langging strand. Kandungan Guanin dan Citosine sebaiknya mendekati atau
50% dari total. Untuk menghindari salah target (mis primer) maka sebaiknya ujung 3’ dihindarkan dari tiga
basa berturut turut pada C dan G. untuk membuat primer tersebut sudah banyak program yang dapat
membantu menganalia. DNA target sebaiknya dibawah 1000 bp. Biasanya untuk target pendek 100-400
lebih sering digunakan untuk memaksimalkan amplifikasi spesifik.Kosentrasi dari perusahaan biasa sebesar
100 µMol. Sehingga disarankan untuk diencerkan sesuai dengan kebubuhan rutin laboratorium.
Jumlah Primer yang terlalu banyak dalau suatu reaksi akan menimbulkan mis primer (salah sasaran
target DNA). Sedangkan penggunaan primer yang sedikit membuat pita DNA yang tipis. Penggunaan Primer
yang lebih dari satu pasang juga di mungkinkan. Keadaan demikian disebut multipleks PCR. Multipleks PCR
seringkali digunakan untuk mendeteksi pathogen. Untuk mendapatkkan
Pada reaksi PCR, primer berperan dalam proses inisiasi dalam polimerasi. Primer yang digunakan
dalam PCR harus memiliki sekuen nukleotida yang komplementer terhadap daerah yang mengapit
segmen DNA target pada template. Amplifikasi gen target membutuhkan dua primer yang berikatan secara
spesifik pada daerah ujung 5’ dan ujung 3’ gen target . Hal tersebut menandakan bahwa desain
primer sangat menentukan spesifisitas reaksi PCR. Untuk reaksi PCR yang optimal, primer yang
digunakan harus memiliki beberapa karakteristik, di antaranya kedua primer yang digunakan sebaiknya
memiliki kandungan G-C yang sama sehingga memiliki temperature melting (Tm) yang sama .
Selain itu, kedua primer yang digunakan sebaiknya tidak mengandung sekuen yang
komplementer antara kedua primer tersebut untuk menghindari pembentukan dupleks antara kedua
primer. Primer yang digunakan sebaiknya tidak mengandung sekuen yang bersifat inverted repeats.
Konsentrasi primer yang digunakan harus sesuai dengan jumlah siklus PCR yang dijalankan, konsentrasi yang
terlalu tinggi menyebabkan efisiensi reaksi PCR yang rendah dan dihasilkan produk PCR yang tidak spesifik.

8.3.4mg 2+

Biologi Molekular “Aplikasi Di Dunia Kesehatan”.